多光子顯微鏡可以在亞細(xì)胞分辨率下對(duì)生物組織進(jìn)行無標(biāo)記三維成像，利用近紅外波段的驅(qū)動(dòng)光源讓組織中的成像深度更深，且不易造成光損傷，這些優(yōu)勢(shì)使得多光子顯微成像成為深腦研究的有力工具。本期介紹用于深腦成像的小型化多光子顯微鏡。

文獻(xiàn)一發(fā)展了一種三光子深腦成像顯微鏡系統(tǒng)，優(yōu)勢(shì)在于可以更高效率地收集彈道區(qū)以外的信號(hào)光，進(jìn)而增加成像深度。三光子顯微成像的激發(fā)光波段一般在1300nm附近，信號(hào)光為520nm左右的綠光，其在灰質(zhì)和白質(zhì)中的平均自由程分別是75um和25um，而灰質(zhì)和白質(zhì)本身的深度約為700um和150um，因此大腦皮層大部分區(qū)域的深度和平均自由程的比值都大于10，不屬于彈道光子，信號(hào)雜散不易收集。在腦科學(xué)研究中，需要測(cè)量實(shí)驗(yàn)對(duì)象在自由活動(dòng)情況下神經(jīng)元對(duì)于某種刺激的反應(yīng)，因而系統(tǒng)要盡可能小且輕。

系統(tǒng)的頭戴部分光路如圖1，其中物鏡為一個(gè)簡(jiǎn)化的無限遠(yuǎn)焦微型物鏡(SIMO)，透鏡更少，長(zhǎng)度更短，表面更平坦，可以更有效收集散射信號(hào)光。阿貝聚光鏡將散射光聚集進(jìn)入柔性纖維束(fiber bundle)，激發(fā)端用了李斯特透鏡作為管鏡，由于阿貝聚光鏡與李斯特透鏡共用其中一組透鏡，且用于區(qū)分激發(fā)光和信號(hào)光的雙色鏡放在透鏡組之間，可以進(jìn)一步壓縮頭戴部分的光路。光束的橫向掃描通過MEMs完成。最終的小型化三光子m3PM系統(tǒng)的頭戴部分重2.17 g，尺寸為2 × 1.6 × 0.9 cm3。

【資料圖】

圖1 m3PM頭戴部分光路圖[1]

使用400 nm熒光珠測(cè)定了水及硅油視野中心的橫向分辨率約為0.97um，軸向分辨率約為7.2μm,接近理論上的衍射極限。又測(cè)試了視野邊緣的分辨率，220×220um2及400×400um2視野邊角的四個(gè)點(diǎn)在水中的分辨率均有所下降，軸向下降更明顯。

圖2 m3PM系統(tǒng)分辨率測(cè)試 [1]

實(shí)驗(yàn)對(duì)固定頭部和自由活動(dòng)的大鼠都進(jìn)行了成像。在頭部固定實(shí)驗(yàn)中，對(duì)PPC貫穿皮層直到表層下970um的區(qū)域都進(jìn)行了三光子、三倍頻成像，見圖3a。不同深度的單個(gè)神經(jīng)元鈣活性瞬態(tài)變化呈現(xiàn)高度異質(zhì)性，見圖3b。幾毫瓦的激光功率足以對(duì)白質(zhì)胼胝體CC以上所有層成像，而對(duì)接近海馬體CA1區(qū)域的皮層下（大概在908um） 區(qū)域需要24.7 mW。白質(zhì)以下，距離表層1.2 mm深度成像所需激光功率為51.5 mW，約為損傷閾值的一半。自由活動(dòng)中的成像結(jié)果見圖3f，依然可以進(jìn)行清晰的深度成像。在持續(xù)觀察20min內(nèi)幅度、衰減時(shí)間以及信噪比均無明顯變化，見圖3h，說明頭戴系統(tǒng)對(duì)小鼠自由活動(dòng)無影響。

圖3 m3PM系統(tǒng)腦成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果[1]

第二篇文章中的小型化系統(tǒng)（圖4a,b）通過離焦來獲得不同深度的圖像，通過調(diào)整輸入端光纖端面與準(zhǔn)直透鏡之間的距離調(diào)整成像深度（圖4a,c），在操作過程中需要考慮可調(diào)節(jié)距離與軸向分辨率之間的折衷平衡（圖4e）。激發(fā)光由光子晶體光纖傳輸，經(jīng)準(zhǔn)直透鏡準(zhǔn)直后進(jìn)入頭戴部分光路，MEMs負(fù)責(zé)完成光束的橫向掃描，再經(jīng)由一組中繼透鏡填充物鏡后孔徑。物鏡聚焦激發(fā)光到生物組織特定深度并收集產(chǎn)生的信號(hào)光，兩者通過雙色鏡分光，信號(hào)光最終進(jìn)入集成在頭戴裝置上的硅光電倍增管。圖4f為從皮層1到CC的三光子（有GCaMP7f標(biāo)記）及三倍頻成像結(jié)果，圖4g為特定深度處的平面圖。

圖4 離焦調(diào)焦小型化MPM系統(tǒng)[2]

為了量化佩戴顯微鏡對(duì)動(dòng)物行為和活動(dòng)的影響，實(shí)驗(yàn)組比較了不戴任何東西的小鼠和佩戴顯微鏡的小鼠活動(dòng)中行進(jìn)的速度，有無顯微鏡的小鼠測(cè)出的中位速度無顯著差異。為了量化顯微鏡對(duì)頭部朝向的影響，還進(jìn)行了對(duì)同一只小鼠三天內(nèi)運(yùn)動(dòng)軌跡的記錄，佩戴前后也無顯著差異。

圖5 頭戴顯微鏡對(duì)小鼠活動(dòng)影響實(shí)驗(yàn)[2]

總而言之，小型化多光子顯微鏡系統(tǒng)是生物醫(yī)學(xué)研究中進(jìn)行深腦成像及神經(jīng)元活動(dòng)監(jiān)測(cè)的有力工具，是多光子顯微成像領(lǐng)域中一個(gè)極具潛力的前沿方向。

參考文獻(xiàn)：